A prevalência da doença renal crônica (DRC) tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas. A ativação exacerbada do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRRA), a reação inflamatória local, o acúmulo de matriz extracelular e a fibrose renal contribuem para a sua evolução. O controle da DRC limita-se atualmente ao emprego de drogas inibidoras do SRAA, diuréticos e fármacos antiinflamatórios, sendo estes últimos relacionados a efeitos colaterais que inviabilizam seu uso por períodos prolongados. Neste contexto, dados recentes têm demonstrado que a aplicação de células tronco mesenquimais (CTm) no tecido renal de animais submetidos à modelos experimentais de DRC, limita a inflamação local e retarda a fibrogênese renal. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos renoprotetores da aplicação subcapsular de 2x106 de CTm derivadas de tecido adiposo (CTmTA) em ratos Wistar submetidos ao modelo de ablação renal de 5/6, além de comparar os efeitos renoprotetores do tratamento com CTmTA à renoproteção obtida no mesmo modelo com a administração oral de Losartan e, verificar se a aplicação subcapsular de CTmTA, associada à terapia com Losartan, promoveria maior renoproteção em relação às respectivas monoterapias. O peso corpóreo dos animais foi monitorado semanalmente. Nos tempos zero, 15 e 30 dias, a pressão caudal foi aferida e a urina de 24 hs coletada para as análises de proteinúria e albuminuria. Aos 30 dias, os animais foram eutanasiados para coleta de sangue e tecidos para análises bioquímicas, histológicas, imunohistoquímicas e moleculares. A associação dos tratamentos se mostrou mais eficaz em reduzir a pressão sistólica, a glomerulosclerose, a infiltração linfocitária e a proliferação celular intersticial, bem como em promover a normalização da infiltração macrofágica no tecido renal dos animais, além da significativa regressão da proteinúria e da albuminúria, quando comparada aos tratamentos com ambas as monoterapias. Neste grupo também foram observados efeitos notórios na expressão gênica de IL-2, IL-4 e IL-6. Nossos resultados nos permitem concluir que a inoculação subcapsular de CTmTA associada a administração de Losartan exerceu importante efeito renoprotetor nos animais, cujos efeitos benéficos devem-se possivelmente, ao papel imunomodulador e anti-inflamatório de fatores secretados por estas células, modulando a resposta imunológica local. (AU)

As feridas, crônicas e agudas, representam um problema crescente não só para os pacientes como também para sistemas de saúde de maneira geral e existe uma gama de pacientes refratários às terapias convencionais. Sendo assim, novas tecnologias usando os princípios da medicina regenerativa e engenharia tecidual estão constantemente sendo incorporadas em terapias inovadoras para o tratamento de feridas. Nesse contexto, a medicina regenerativa por meio da terapia celular e mais recentemente, a terapia com exossomos, tem emergido como alternativa de tratamento para esses pacientes. Dentre as células utilizadas terapeuticamente, as células mesenquimais (CMs) destacam-se principalmente por suas propriedades imunomoduladoras e regenerativas. Grande parte do potencial terapêutico dessas células vem sendo atribuído à secreção de moléculas bioativas muitas vezes contidas em suas vesículas extracelulares (VEs), ou mais especificamente nos exossomos. Em uma primeira abordagem, a In Situ Terapia Celular desenvolveu um biocurativo 3D contendo CMs para o tratamento de pacientes portadores de feridas crônicas e queimaduras graves. Entretanto, sabendo do potencial terapêutico das VEs que são secretadas pelas células no meio de cultivo, iniciamos o desenvolvimento do nosso segundo produto que é uma formulação de uso tópico para o tratamento de feridas, contendo exossomos que são reciclados do meio de cultivo celular durante o processo de fabricação dos biocurativos. Na primeira fase desse projeto mostramos que os exossomos purificados em escala laboratorial usando o protocolo de ultrafiltração/ultracentrifugação apresentaram características biológicas satisfatórias e capacidade de estimular a proliferação de fibroblastos in vitro, e que a formulação em gel de uso tópico contendo esses exossomos apresentou-se como não fototóxica e não irritante em ensaios in vitro de segurança. A integridade dos exossomos é essencial para a sua atividade biológica e é, portanto, um dos principais requisitos para o desenvolvimento de métodos de isolamento em larga escala. Sendo assim, o objetivo deste projeto é otimizar uma plataforma de obtenção de exossomos derivados de CMs através da implantação do isolamento em larga escala de tal maneira que garanta a manutenção das propriedades regenerativas dessas VEs, assim como incorporar esses exossomos a uma formulação de uso tópico destinada ao tratamento de feridas de pele. Para tal, CMs derivadas de cordão umbilical humano serão isoladas e cultivadas seguindo as condições GMP (Good Manufacturing Practice). Os exossomos secretados pelas CMs no meio de cultura serão isolados utilizando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) e caracterizados. A caracterização dos exossomos será feita por análise de tamanho, imunofenotipagem, western blotting e análise de expressão de MicroRNAs. Após a caracterização, os exossomos serão incorporados a formulações de uso tópico que serão testadas no modelo experimental de ferida em camundongos. A aceleração do processo de cicatrização das feridas indicará a eficácia terapêutica das formulações contendo os exossomos. Os mecanismos envolvidos no processo de regeneração tecidual serão avaliados por análises histopatológicas e imunológicas. Dessa maneira, a partir dos resultados obtidos nesse projeto, e continuando com os testes clínicos em uma fase posterior, acreditamos que iremos inserir no mercado um produto de medicina regenerativa seguro e eficaz para o tratamento de feridas baseado em exossomos de CMs. Nosso propósito é desenvolver um produto inovador que irá beneficiar pacientes carentes de soluções efetivas para o tratamento de feridas. (AU)

A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões chamadas de microambientes, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto-renovação da célula-tronco hematopoética (CTH). Nos últimos anos a literatura tem chamado atenção para o papel das células que compreendem e formam esses microambientes com destaque para a célula estromal mesenquimal. Adicionalmente, pessoas com idade mais avançada normalmente sofrem de algum grau de carência nutricional, sendo a mais comum a carência proteica, o envelhecimento e a desnutrição proteica estão diretamente relacionados ao comprometimento da hematopoese. Diante do exposto, e baseado em dados prévios que comprovam que o envelhecimento e a desnutrição proteica comprometem a hematopoese, e que microambiente medular apresenta distintos moduladores que atuam sinergicamente para influenciar a sobrevivência, proliferação e o desenvolvimento das células hematopoéticas em todos os seus níveis de diferenciação, esse projeto tem como objetivo desvendar alguns aspectos regulatórios da hematopoese, priorizando o estudo dos mecanismos envolvidos na participação das células estromais mesenquimais e avaliar aspectos da complexa regulação estromal sobre a hematopoese. (AU)

Estratégias para otimizar a regeneração de defeitos ósseos com o emprego de células-tronco mesenquimais (CTM) de diferentes origens vêm sendo investigadas. CTMs derivadas do tecido adiposo (CTM-TA) são uma alternativa interessante uma vez que são obtidas em maior quantidade por métodos menos traumáticos e onerosos, comparado às CTMs de outras origens. Contudo, às CTM-TA têm sido atribuído um menor potencial osteogênico, o que limita seu uso. Para potencializar a diferenciação celular, a fotobiomodulação (FBM) surge como uma terapia não invasiva e que tem sido relacionada à aceleração do processo de reparo. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto é investigar a fotobiomodulação (FBM) como uma alternativa terapêutica para potencializar a diferenciação osteoblástica de CTM-TA para serem empregadas como terapia celular no reparo de defeitos ósseos. Para tanto, CTM-TA de ratos mantidas em meio de expansão ou osteogênico serão submetidas à FBM (660 nm; 0,14 J; 20 mW; 0,714 W/cm2 e 5 J/cm2). A diferenciação de CTM-TA tratadas com FBM ou cultivadas em meio condicionado por CTM-TA irradiadas será avaliada por expressão gênica e proteica de marcadores ósseos, pela atividade de ALP e pela produção de matriz mineralizada. O meio condicionado será caracterizado quanto a expressão de um painel de proteínas. Defeitos ósseos de calvárias de ratos serão implantados com CTM-TA tratadas com FBM ou meio condicionado por CTM-TA irradiadas, e o reparo avaliado por análises microtomográfica e histológica. Os dados serão comparados por testes estatísticos apropriados de acordo com a aderência à curva normal, com nível de significância de 5%. Os resultados desse estudo contribuirão para o entendimento dos mecanismos intracelulares desencadeados pela FBM e envolvidos com a diferenciação osteoblástica de CTM-TA, favorecendo o reparo. (AU)

O objetivo deste projeto é avaliar, no período de 12 meses, a regeneração óssea a partir de compósito à base de nanotubo de carbono, hidroxiapatita e quitosana associado ou não as células-tronco mesenquimais (CTM) injetadas em falhas ósseas em tíbias de ovinos. Doze ovelhas serão submetidas a ostectomia em terço médio da diáfise da tíbia direita de 30mm e divididas em dois grupos: Grupo BIO, com aplicação do compósito de nanotubo de carbono, quitosana e hidroxiapatita; grupo BIOCT, com a aplicação do mesmo compósito e administração de cultura de CTM quatro semanas após a cirurgia. Serão realizados exames radiográficos, ultrassonográficos e termográficos em intervalos de 30 dias. Aos 12 meses os animais serão submetidos à eutanásia e as tíbias serão encaminhadas para microtomografia computadorizada tridimensional e exames histológicos para avaliação da regeneração óssea. Tem-se como hipótese que as falhas ósseas preenchidas com compósito de nanotubo de carbono, quitosana e hidroxiapatita em adição às células-tronco mesenquimais injetadas após quatro semanas da realização da falha óssea irão apresentar regeneração compatível com tecido funcional. (AU)

A pele desempenha funções vitais ao organismo, e a perda de sua integridade, como observado em feridas complexas, resulta em um conjunto de complicações. Patologias de base, como a anemia falciforme, estão comumente relacionadas ao desenvolvimento de feridas crônicas. Essas feridas, bem como outras lesões graves de pele tais como as ocasionadas por queimaduras profundas e extensas estão associadas a piores prognósticos, longos períodos de tratamento e altos custos para os sistemas de saúde. Diversas alternativas terapêuticas encontram-se disponíveis, porém existe uma gama de pacientes refratários às terapias convencionais. Nesse contexto, a medicina regenerativa por meio da terapia celular tem emergido como alternativa terapêutica para esses pacientes. Dentre as células utilizadas terapeuticamente, as células mesenquimais (CMs) destacam-se principalmente por suas propriedades imunomoduladoras e regenerativas. Contudo, o método para administração dessas células representa um desafio para a translação da terapia celular. Assim, a utilização de estratégias da engenharia de tecidos e da bioimpressão tridimensional (3D) permite a obtenção de estruturas celulares tridimensionais reprodutíveis, garantindo não só a manutenção do potencial terapêutico das células como também a segurança do processo de terapia celular e seu fornecimento de maneira menos invasiva aos pacientes. Dessa forma, o presente projeto visa utilizar biocurativos 3D desenvolvidos pela startup In Situ Terapia Celular para o tratamento de feridas complexas em regiões doadoras de pacientes queimados e pacientes portadores de anemia falciforme. Esses biocurativos, produzidos pela técnica de bioimpressão 3D contém células mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano. Uma vez que feridas complexas acarretam grandes prejuízos aos indivíduos, além de gastos elevados, acreditamos que esse projeto de pesquisa possa embasar a terapia celular por meio da utilização de biocurativos 3D como alternativa de tratamento para esses pacientes, melhorando seu prognóstico e qualidade de vida, bem como minimizando o ônus que o tratamento dessas feridas representa aos sistemas de saúde. Além disso, o biocurativo 3D é um produto de tecnologia nacional, o que pode facilitar o acesso dos brasileiros à terapia celular. (AU)

O infarto do miocárdio (IM) causa perda irreversível de cardiomiócitos com substituição por tecido fibroso, culminando em remodelamento cardíaco adverso e insuficiência cardíaca (IC). Esse cenário é propício para o desenvolvimento de arritmias ventriculares complexas e, consequentemente, a presença de taquicardia (TV) e fibrilação (FV) ventriculares constitui rotina na prática clínica. Nos últimos anos, considerando os efeitos bem documentados das células-tronco mesenquimais (CTMs) no remodelamento cardíaco, postulou-se a hipótese do uso da terapia celular como intervenção antiarrítmica após IM. Embora alguns estudos tenham ilustrado benefícios das CTMs, outros investigadores documentaram efeito pró-arrítmicos ou ação nula da terapia. Adicionalmente, ainda não é conhecido se os possíveis efeitos antiarrítmicos das CTMs estão presentes na fase aguda do IM, durante a insuficiência cardíaca congestiva ou ambos. Consequentemente, o estudo proposto à FAPESP foi desenhado para examinar o padrão arritmogênico em corações de ratos infartados sujeitados ao transplante de CTMs derivadas do tecido adiposo (CTMAs). Para caracterizar as ações da terapia celular no curso temporal da doença, ratas com infartos grandes receberão o transplante de CTMAs com três e trinta dias após oclusão coronariana, respectivamente. Os eventos elétricos serão registrados por meio de eletrocardiograma de superfície e um cateter octopolar implantado dentro do VE que possibilita induzir e registrar arritmias ventriculares. Para fundamentar os resultados encontrados, analisaremos o teor miocárdico de diferentes tipos de colágeno, conexinas e citocinas inflamatórias sabidamente envolvidas na gênese da arritmia ventricular pós-IM. Acresça-se o estudo do estresse oxidativo miocárdico como análise válida em nossos experimentos. (AU)

A doença renal diabética (DRD) é a principal causa de doença renal crônica (DRC) ao redor do mundo. Afeta pessoas de todas as idades, sexo e etnia. A ocorrência de lesão renal aguda (LRA) predispõe à DRC e pode agravar a função renal de indivíduos com DRC em tratamento conservador. O bloqueio do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) é o padrão-ouro para retardar a progressão da DRD, além de mudanças no estilo de vida. Recentemente, os inibidores do co-transportador sódio-glicose-2 (iSGLT2) demonstraram benefício na redução da progressão da DRD através do controle glicêmico, da restauração do feedback túbulo-glomerular e também modulação das vias de sinalização que se encontram desreguladas na DRD, com estresse oxidativo e fibrose. No entanto, em outras DRCs, como glomerulopatias e nefroesclerose hipertensiva, os iSGLT2 demonstraram eficácia em reduzir a progressão da DRC, sugerindo que os efeitos destas medicações independem do controle glicêmico. Desta forma, intencionamos estudar o efeito dos iSGLT2 utilizando o camundongo BTBRob/ob, homozigoto para o knockout do gene da leptina, que é um modelo pré-clínico reversível de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e DRD, caracterizado por desenvolvimento precoce de obesidade, hiperfagia, resistência à insulina e hiperglicemia (6ª semana de idade), seguido pelo estabelecimento da DRD com níveis crescentes de albuminúria, dependente do tempo (8ª semana de idade), semelhante às alterações da DRD nos seres humanos, como expansão mesangial, podocitúria e infiltração de macrofágos. Um assunto também emergente da literatura é a existência de células-tronco/progenitoras específicas do tecido renal e sua capacidade regenerativa renal. Nosso grupo documentou previamente a existência de uma população de células-tronco/progenitoras específicas do tecido renal identificadas com o marcador c-Kit (CD117) e com capacidade de reparar o tecido renal após insultos agudos, como a lesão de isquemia-reperfusão e síndrome nefrótica. Desta forma, no presente projeto estamos propondo avaliar a combinação de terapias, como o uso de empagliflozina (iSGLT2), restrição calórica, células-troncos mesenquimais (CTMs), terapia gênica com o klotho com a finalidade de acelerar a recuperação da lesão renal e estacionar a progressão da DRD através da modulação do estresse oxidativo, morte celular e senescência celular, de modo que buscamos também compreender o papel das células-tronco/progenitoras específicas do tecido renal c-Kit positivas nestes cenários através da técnica de lineage tracing. Projeto 1: Utilizaremos o camundongo BTBRob/ob, que será pré-condicionado com empagliflozina (25 mg/kg/ração) e restrição calórica (30%) e tratado com CTMs e klotho. Serão avaliados desfechos clínicos gerais (peso, glicemia e insulina plasmática) e parâmetros funcionais renais (taxa de filtração glomerular, volume de diurese, glicosúria e albuminúria) e estruturais renais (número de podócitos, expansão mesangial, estresse oxidativo, apoptose, senescência e fibrose). Nos experimentos de co-cultura com podócitos ou células do túbulo proximal com CTMs nos meios de condicionamento associado à Angiotensina-II, iremos avaliar o mecanismo de ação do klotho através da interação NOX4-TRPC6, bem como estresse oxidativo, apoptose e senescência celulares. Projeto 2: Nos modelos de lesão renal aguda (LRA) por isquemia-reperfusão e rabdomiólise induzida pelo glicerol, avaliaremos a eficácia do pré-condicionamento com empagliflozina (25 mg/kg/ração) e o impacto do tratamento das CTMs e klotho nos desfechos funcionais (creatinina e uréia plamáticas) e estruturais (escore de LRA, estresse oxidativo, apoptose, senescência e fibrose). Utilizando o camundongo c-KitCreERT2/+;mTmG injetado com Tamoxifeno, verificaremos o rastreio das células-tronco/progenitoras EGFP-c-Kit e o impacto daquelas estratégias terapêuticas na manutenção, proliferação e diferenciação do pool das células c-Kit in vivo. (AU)

Sepse induz disfunção orgânica devido à superexpressão da resposta inflamatória do hospedeiro, resultando em disfunção cardiopulmonar e autonômica, aumentando a morbimortalidade associada. As células-tronco mesenquimais derivadas de geléia da Wharton (WJ-MSCs) expressam genes e secretam fatores com propriedades anti-inflamatórias, neurológicas e imunológicas proteção, bem como melhorar a sobrevida na sepse experimental. A via anti-inflamatória colinérgica (PAC) é mediada por receptores 7-nicotínicos de acetilcolina (7nAChRs), que desempenham papel importante no controle da inflamação sistêmica. Nossa hipótese foi de que WJ-MSCs atenuam lesão de órgão induzida por sepse na presença de uma via CAP ativada. Para confirmar nossa hipótese, avaliamos os efeitos dos WJ-MSCs como tratamento para doenças cardiopulmonares.lesão e neuroimunomodulação. Ratos Wistar machos foram randomizados dividido em quatro grupos: controle (operação simulada); ligadura cecale punção (CLP) sozinho; CLP WJ-MSCs (1 106 células, a 6h pós-CLP); WJ-MSCs de CLP metillicaconitina (MLA) (5mg / kg de peso corporal, às 5,5 h pós-CLP, e 1 106 células, às 6 h pós-CLP,respectivamente). Todas as experiências, incluindo a avaliação do ecocardiograma parâmetros e variabilidade da frequência cardíaca, foram realizadas 24 h depois do CLP. O tratamento WJ-MSC atenuou a disfunção diastólica e sensibilidade barorreflexa restaurada. WJ-MSCs também aumentaram a capacidade simpática cardíacae atividade cardiovagal. WJ-MSCs reduziram a infiltração de leucócitos citocinas pró-inflamatórias, efeitos que foram abolidos por administração de um antagonista seletivo de 7nAChR (MLA). O tratamento WJ-MSC também diminuiu a apoptose nos pulmões e baço. No tecido cardíaco e esplênico, as CTM dos WJ diminuíramexpressão de 7nAChR, bem como reduziu a quantidade total de fosfo-STAT3 Relação STAT3 no baço. WJ-MSCs parecem proteger contra lesão de órgão induzida por sepse, reduzindo a inflamação sistêmica, pelo menos em parte, através de um mecanismo que depende de umCAP ativado. (AU)